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木糖醇是一种功能性五碳糖醇,广泛应用于食品、制药和石化行业。微生物合成木糖醇使用来自农业废弃物和能源作物如玉米芯、柳枝稷等的木质纤维素资源作为基质,通过酸水解和酶消化等过程,释放葡萄糖和木糖等可发酵糖,重组微生物通过表达木糖还原酶将这些糖转化为木糖醇。然而,玉米芯水解物存在毒性和葡萄糖分解代谢抑制,木糖醇的生产受到限制。
在大肠杆菌中,磷酸转移酶系统 (phosphotransferase system,PTS)是葡萄糖的主要转运系统,由酶I EI( ptsH 编码)、组氨酸磷酸载体蛋白HPr ( ptsI 编码)以及酶II复合物EIIA Glc ( crr 编码)和EIIBCGlc(ptsG编码)组成。,PTS中磷酸化的EIIAGlc能够结合并激活腺苷酸环化酶 (adenylate cyclase,AC)合成 cAMP。当葡萄糖经PTS进入细胞被磷酸化为葡萄糖-6-磷酸,磷酸化的EIIAGlc减少,导致AC活性降低,cAMP 水平也随之降低。细胞在摄入半纤维素衍生的混合糖时,非 PTS 糖如木糖、阿拉伯糖的分解代谢基因需要由cAMP与环AMP受体蛋白(cyclic AMP receptor protein , CRP)形成的复合物激活,当细胞内cAMP处于低浓度时,cAMP-CRP 复合物形成减少,会阻碍这些次级糖分解代谢操纵子的转录。通过失活ptsG基因造成PTS部分功能缺失可以减缓葡萄糖进入细胞,缓解葡萄糖分解代谢抑制,但是会抑制细胞生长。在没有cAMP的情况下变构激活CRP,进一步调节DNA结合和全局转录,可能是一种很有前途的方法。CRP是大肠杆菌的七大全局调控因子之一,已被证明可以调控数百个细胞代谢相关基因的表达。研究表明对其进行突变除了缓解葡萄糖分解代谢抑制CCR效应外,还有助于提高菌株的鲁棒性,比如改善大肠杆菌在有毒底物中的生长。位于 cAMP 结合口袋(S62、E72、R82、S83、R123、T127 和 S128)周围的 CRP 残基一直是大量研究的重点。
近日,浙大连佳长等在《J. Agric. Food Chem.》发表文章“Multisite Mutation of the Escherichia coli cAMP Receptor Protein: Enhancing Xylitol Biosynthesis by Activating Xylose Catabolism Improving Strain Tolerance”,选择CRP的S83和S128氨基酸残基作为修饰靶点进行组合突变,成功地增强了木糖的分解代谢。还提高了菌株对玉米芯水解物的耐受性。得到的突变菌株在20L生物反应器中进行发酵,并半连续地加入玉米芯水解物。41小时内木糖醇滴度和生产强度分别为175和4.32 g/L/小时。
综上,该菌株使用未经毒性处理的玉米芯水解产物作为底物,达到了有史以来最高显著的木糖醇生产水平。、